手性化合物在药物、农药、香料及功能材料等领域具有重要应用，因此高效构建光学纯分子一直是有机合成的重要目标。其中，去对称化反应是一种高效的手性构建策略，通过选择性转化分子中两个等价位点之一，可以在单一步骤中形成手性中心，并具有较高的原子经济性。

在众多潜在底物中，氧杂丁环是一类重要的四元含氧杂环结构。由于其较大的环张力（约 25.5 kcal/mol），氧杂丁环具有较高的反应活性，同时在药物化学中常被用作羰基或 gem-二甲基的生物电子等排体，因此在现代药物设计中具有重要价值。特别是 3-取代氧杂丁环，通过去对称化反应能够生成具有明确立体结构的 γ-取代醇类化合物，这类结构是许多药物分子的重要合成砌块。

研究背景

尽管氧杂丁环具有较高反应活性，但 3-取代氧杂丁环的分子间不对称开环反应仍然十分有限。现有研究主要依赖分子内亲核反应，而分子间亲核开环的对映选择性方法报道较少。目前仅有少数有机催化体系能够实现该类转化，例如手性磷酸催化体系和 squaramide 催化体系，但在底物适用范围和反应效率方面仍存在一定局限。

近年来，生物催化因其高选择性和环境友好等优势，在不对称合成中受到广泛关注。其中卤代醇脱卤酶能够催化环氧化物及相关小环结构的开环反应，因此被认为可能用于氧杂丁环的转化。然而，在此之前，利用 HHDH 催化 3-取代氧杂丁环去对称化反应的研究几乎没有报道。

基于此，作者提出一个关键问题：

能否通过酶工程改造 HHDH，实现 3-取代氧杂丁环的高对映选择性分子间去对称化反应？

主要内容

 

本工作的目标是建立一个高对映选择性的生物催化平台，实现：

3-取代氧杂丁环 + 叠氮离子→ 手性 γ-叠氮醇

关键技术路线包括：

1. 酶库筛选（enzyme screening）
2. 定向进化（directed evolution）
3. 结构指导的蛋白工程（structure-guided engineering）
4. 反应条件优化
5. 底物范围探索与放大实验

最终构建一个高效催化体系。

1、酶筛选与初始催化剂发现

作者首先以 3-苯基氧杂丁环 (1a) 为模型底物进行酶筛选。

筛选范围包括：

• 82 种 HHDH 酶
• 多个工程化突变体

结果令人意外：大多数酶完全没有活性。

这一结果说明：

3-取代氧杂丁环的开环反应具有较高的催化难度。

最终仅发现两个具有活性的酶突变体：

• HheG-M1 (I104W)
• HheG-M2 (I104F)

其中 HheG-M2 活性稍高：产率：10% ee：>99%

并且生成 R 构型产物。 虽然转化率较低，但其 极高的对映选择性 表明该酶具有良好的发展潜力。

2、蛋白工程优化

为了提高催化效率，作者进行了多轮结构指导突变

通过分子对接得到底物在酶活性中心的结合模式。

关键催化三联体：

S152
Y165
R169

作用机理：

1. 底物 oxetane 与 S152、Y165 形成氢键
2. 叠氮离子从侧面进攻
3. Y165 参与质子转移
4. 发生环开裂生成 γ-azidoalcohol

同时发现：

I104F 突变可与底物芳环产生 π-π 相互作用，增强底物结合能力。

3、多轮定向进化

作者通过位点饱和突变 (SSM) 持续优化酶活性。

关键突变路径：

HheG-M2
→ HheG-M9 (I104F/Y18F)
→ HheG-M11 (I104F/Y18F/T106Y)
→ HheG-M12 (I104F/Y18F/T106Y/V105I)
→ HheG-M14 (I104F/Y18F/T106Y/V105I/L103W)

最终结果：

产率从 10% 提高到 74%。

而整个进化过程中：ee 始终保持 >99%。

说明该酶具有非常稳定的立体控制能力。

4、反应条件优化

作者进一步优化反应体系：

关键条件：

缓冲液：CASC buffer
pH：6.0
温度：30 °C
叠氮离子：3 eq

最优条件下：

反应时间：6 h
产率：>99%
ee：>99%

作者发现：

• 较低 pH 有利于反应
• 高缓冲浓度 有助于维持酸性环境

因为该开环过程需要 质子供体参与机制。

5、底物适用范围

在优化条件下，作者考察了大量底物。

1 芳基取代底物

包括：

邻位取代
间位取代
对位取代

电子给体或吸电子基团均可：

Ome  F  Cl  CF₃ 等

产率：87–98%  ee：99%

表现出非常好的普适性。

2 杂环底物

可兼容：

• 呋喃
• 噻吩
• 吡啶

产率：93–95%

说明体系对杂环也具有良好兼容性。

3 烷基底物

烷基取代氧杂丁环也可以反应，但效率下降：61–76% yield

4 反应限制

以下底物无法反应：

• 3,3-二取代 oxetane
• 某些空间位阻较大底物

同时该体系只适用于：

叠氮离子

而：CN⁻  SCN⁻  NO₂⁻均不能反应。

说明该体系存在一定 亲核试剂选择性。

6、放大反应与工业潜力

作者测试了较高底物浓度。

结果：

50 mM → 完全转化
200 mM → 完全转化
300 mM → 95% 转化

说明该酶具有较高稳定性。

此外还进行了 克级反应：

底物：10 mmol
产物：1.62 g
收率：92%
ee：>99%

证明该体系具有实际应用潜力。

7、产物转化

得到的 γ-azidoalcohol 可以进一步转化为多种有价值结构。

例如：

1️⃣ Click 反应
生成手性三唑化合物

2️⃣ Staudinger 反应
生成γ-氨基醇

3️⃣ Schmidt 反应
生成中环内酰胺

4️⃣ Williamson 反应
生成醚类化合物

说明该产物是非常重要的 手性合成中间体。

总结

该研究开发了一种基于 卤代醇脱卤酶（HHDH）工程化突变体 的生物催化体系，实现了 3-取代氧杂丁环的高对映选择性去对称化反应。通过酶筛选、结构指导的定向进化以及反应条件优化，作者获得了突变体 HheG-M14，能够高效催化氧杂丁环与叠氮离子的开环反应，生成 γ-叠氮醇，收率最高可达 99%，对映选择性超过 99% ee。该体系不仅具有广泛的底物适用性，还能够在高底物浓度和克级规模下保持良好效率，并可通过多种后续反应转化为具有药物价值的手性分子。该工作展示了 酶工程在发展非天然反应中的巨大潜力，为构建手性氧杂丁环衍生物提供了一种绿色、高效且可规模化的合成策略。

文章链接

https://doi.org/10.1021/acscatal.5c08014